Chloroquine 177

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La chloroquine est un puissant inhibiteur du SRAS infection par le coronavirus et la propagation Contexte du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS) est causée par un coronavirus nouvellement découvert (SRAS-CoV). Aucune thérapie efficace post-exposition prophylactique ou est actuellement disponible. Résultats Nous signaler, cependant, que la chloroquine a de forts effets antiviraux sur l'infection par le SRAS-CoV des cellules de primate. Ces effets inhibiteurs sont observés lorsque les cellules sont traitées avec le médicament soit avant soit après l'exposition au virus, ce qui suggère un avantage à la fois prophylactique et thérapeutique. En plus des fonctions bien connues de chloroquine tels que des élévations de endosomal pH, le médicament semble interférer avec la glycosylation terminale du récepteur cellulaire, l'enzyme de conversion 2. Ce peut influencer négativement la liaison du virus-récepteur et abrogera l'infection, avec d'autres ramifications par l'élévation du pH vésiculaire, entraînant l'inhibition de l'infection et la propagation du SRAS CoV à des concentrations cliniquement admissibles. Conclusion chloroquine est efficace pour prévenir la propagation du SRAS CoV en culture cellulaire. inhibition favorable de la propagation du virus a été observé lorsque les cellules ont été soit traités avec la chloroquine avant ou après infection par le SRAS CoV. En outre, le dosage par immunofluorescence indirecte décrite ici représente une méthode simple et rapide pour le dépistage du SARS-CoV composés antiviraux. Mots-clés syndrome respiratoire aigu sévère coronavirus chloroquine inhibition thérapeutique Contexte du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS) est une maladie émergente qui a été signalée pour la première dans la province de Guangdong, en Chine, à la fin de 2002. La maladie se propager rapidement à au moins 30 pays dans les mois de sa première apparition , et des efforts concertés dans le monde entier ont conduit à l'identification de l'agent étiologique que le coronavirus du SRAS (SRAS-CoV), un nouveau membre de la famille Coronaviridae 1. séquençage du génome complet du SRAS-CoV 2. 3 a confirmé que cet agent pathogène est pas étroitement lié à l'un des groupes de coronavirus précédemment établies. Bourgeonnement du SRAS-CoV se produit dans l'appareil de Golgi 4 et les résultats de l'incorporation de la pointe de la glycoprotéine d'enveloppe dans le virion. La glycoprotéine de spicule est une protéine membranaire de type I, qui facilite la fixation du virus au récepteur cellulaire et l'initiation de l'infection et l'enzyme de conversion de l'angiotensine 2 (ACE2) a été identifié comme un récepteur cellulaire fonctionnel du SARS-CoV 5. Nous avons récemment montré que le traitement de la protéine de spicule a été effectuée par les convertases de type furine et que l'inhibition de ce clivage par un inhibiteur spécifique et Abrogé cytopathogène a réduit significativement le titre du virus du SARS-CoV 6. En raison de la gravité de l'infection du SRAS-CoV, le potentiel de propagation rapide de la maladie, et l'absence de preuves efficace et sûr dans les inhibiteurs in vivo du virus, il est important d'identifier les médicaments qui peuvent effectivement être utilisés pour traiter ou prévenir le potentiel infections du SRAS-CoV. Beaucoup de nouvelles approches thérapeutiques ont été évalués dans des études de laboratoire du SRAS-CoV: notable parmi ces approches sont ceux qui utilisent siRNA 7, le transfert d'anticorps passive 8, la vaccination d'ADN 9, la vaccine ou le virus parainfluenza exprimant la protéine spike 10. 11, interférons 12. 13 et un anticorps monoclonal contre la sous-unité S1 de la glycoprotéine spike qui bloque la liaison au récepteur 14. Dans ce rapport, nous décrivons l'identification de la chloroquine comme un pré - et post-infection agent antiviral efficace pour le SRAS-CoV. Chloroquine, un 9-aminoquinoléine qui a été identifié en 1934, est une base faible qui augmente le pH des vésicules acides. Lorsqu'il est ajouté de manière extracellulaire, la portion non protonée de la chloroquine pénètre dans la cellule, où elle devient protoné et concentrée sous acides, des organites à faible pH, comme les endosomes, les vésicules de Golgi, et les lysosomes. Chloroquine peut affecter l'infection virale de plusieurs façons, et l'effet antiviral dépend en partie de la mesure dans laquelle le virus utilise les endosomes d'entrée. La chloroquine a été largement utilisé pour traiter les maladies humaines, telles que le paludisme, amoebiosis, le VIH et les maladies auto-immunes, sans effets secondaires néfastes significatifs 15. Ensemble avec les données présentées ici, montrant l'inhibition du virus en culture cellulaire par des doses de chloroquine compatibles avec le traitement des patients, ces caractéristiques suggèrent que la poursuite de l'évaluation de la chloroquine dans des modèles animaux d'infection du SRAS-CoV serait justifié que nous progressons vers la recherche d'antiviraux efficaces pour la prévention ou le traitement de la maladie. traitement Résultats avant l'infection de chloroquine rend les cellules Vero E6 réfractaires à l'infection par le SRAS-CoV Afin d'étudier si la chloroquine pourrait prévenir l'infection du SRAS-CoV, permissives cellules Vero E6 1 ont été prétraités avec différentes concentrations de chloroquine (0,110 M) pour 2.024 h avant l'infection par le virus . Les cellules ont ensuite été infectées par le SARS-CoV, et des antigènes de virus ont été visualisées par immunofluorescence indirecte, comme décrit dans Matériels et Méthodes. L'examen au microscope (Fig. 1A) des cellules témoins (non traités, infectés) a révélé une immunocoloration du SARS-CoV spécifique de la monocouche. Une diminution de la dose-dépendante dans les cellules virus antigène-positifs a été observée à partir de 0,1 M chloroquine, et des concentrations de 10 M complètement abolie infection par le SRAS-CoV. Pour les besoins quantitatifs, nous avons compté le nombre de cellules colorées positives à partir de trois emplacements aléatoires sur une diapositive. Le nombre moyen de cellules témoins colorées positivement a été marqué comme 100 et a été comparé avec le nombre de cellules positives observées sous diverses concentrations de chloroquine (Fig. 1B). Pré-traitement avec 0,1, 1 et 10 M chloroquine réduit l'infectiosité de 28, 53 et 100, respectivement. Des résultats reproductibles ont été obtenus à partir de trois expériences indépendantes. Ces données démontrent que le prétraitement des cellules Vero E6 avec de la chloroquine a rendu ces cellules réfractaires à l'infection par le SARS-CoV. effet prophylactique de la chloroquine. cellules Vero E6 pré-traitées avec de la chloroquine pendant 20 heures. des milieux contenant de la chloroquine ont été enlevés et les cellules ont été lavées avec une solution saline tamponnée phosphate avant d'être infectés par le SARS-CoV (multiplicité d'infection de 0,5) pendant 1 h. en l'absence de chloroquine. Le virus a été ensuite éliminé et les cellules ont été maintenues dans OptiMEM (Invitrogen) pendant 1618 h en l'absence de chloroquine. antigènes du SRAS-CoV ont été colorées avec HMAF spécifique du virus, suivie par des anticorps secondaires conjugués au FITC. (A) La concentration de la chloroquine utilisée est indiquée sur la partie supérieure de chaque panneau. (B) SARS-CoV cellules positives à l'antigène à trois endroits aléatoires ont été capturés à l'aide d'un appareil photo numérique, le nombre de cellules positives à l'antigène a été déterminé, et l'inhibition moyenne a été calculée. Le pourcentage d'inhibition a été obtenue en considérant le témoin non traité comme 0 inhibition. Les barres verticales représentent la gamme de SEM. le traitement post-infection de chloroquine est efficace pour prévenir la propagation de l'infection par le SRAS-CoV Afin d'étudier les propriétés antivirales de la chloroquine sur le SRAS-CoV après le début de l'infection, les cellules Vero E6 ont été infectées par le virus et du milieu frais additionné de différentes concentrations de chloroquine on a ajouté immédiatement après l'adsorption du virus. Les cellules infectées ont été incubées pendant 1618 heures supplémentaires, après quoi la présence d'antigènes de virus a été analysée par une analyse par immunofluorescence indirecte. Lors de la chloroquine a été ajouté après le début de l'infection, on observe une diminution dose-dépendante dramatique du nombre de cellules positives à l'antigène de virus (Fig. 2A). Aussi peu que 0,11 M chloroquine réduit l'infection par 50 et jusqu'à 9094 inhibition a été observée avec 33100 M concentrations (Fig. 2B). A des concentrations de chloroquine supérieures à 1 M, seul un petit nombre de cellules individuelles ont été initialement infecté, et la propagation de l'infection à des cellules adjacentes a été pratiquement éliminé. a été estimé un effet demi-maximal inhibitrice de se produire à 4.4 1.0 M chloroquine (Fig. 2C). Ces données montrent clairement que l'addition de chloroquine peut réduire efficacement la mise en place de l'infection et la propagation du SRAS-CoV si le médicament est ajouté immédiatement après l'adsorption du virus. traitement par la chloroquine post-infection réduit l'infection par le SRAS-CoV et la propagation. cellules Vero E6 ont été ensemencées et infecté comme décrit pour la figure. 1, sauf que la chloroquine a été ajoutée seulement après adsorption du virus. Les cellules ont été maintenues dans OptiMEM (Invitrogen) contenant de la chloroquine à 1618 h, après quoi elles ont été traitées par immunofluorescence. (A) La concentration de chloroquine est indiquée sur le dessus. (B) Le pourcentage d'inhibition et SEM ont été calculées sur la Fig. 1B. (C) La dose efficace (ED 50) a été calculée en utilisant un logiciel commercial disponible (Grafit, la version 4, Erithacus Software). L'analyse au microscope électronique indique l'apparition de quantités importantes de virus extracellulaire particules de 56 16 heures après l'infection. Depuis, nous avons observé des effets antiviraux par chloroquine immédiatement après l'adsorption du virus, nous avons encore étendu l'analyse en ajoutant chloroquine 3 et 5 h après l'adsorption du virus et examiné pour la présence d'antigènes du virus après 20 h. Nous avons trouvé que la chloroquine était encore significativement efficace, même quand ils sont ajoutés à 5 h après l'infection (Fig. 3), cependant, pour obtenir un effet antiviral équivalent, une concentration plus élevée de la chloroquine a été nécessaire si le médicament a été ajouté 3 ou 5 heures après l'adsorption. Timed traitement post-infection avec la chloroquine. Cette expérience est similaire à celle représentée sur la Fig. 2, sauf que les cellules ont été infectées à une multiplicité d'infection et de la chloroquine (10, 25 et 50 M), on a ajouté 3 ou 5 h après l'infection. Le chlorure d'ammonium inhibe l'infection du SRAS-CoV de cellules Vero E6 Depuis chloroquine inhibe l'infection du SRAS-CoV lorsqu'il est ajouté avant ou après l'infection, nous avons supposé que un autre agent lysosomotrope commune, NH 4 Cl, peut également fonctionner d'une manière similaire. Le chlorure d'ammonium a été largement utilisé dans les études portant sur l'entrée du virus endosome médiation. Coïncidemment, NH 4 Cl a été récemment montré pour réduire la transduction des virus pseudotype décorés par le SRAS-CoV pic protéique 17. 18. Dans une tentative pour étudier si les fonctions NH 4 Cl est similaire à la chloroquine, nous avons effectué des analyses de l'infection dans des cellules Vero E6 avant (Fig. 4A) et après (Fig. 4B), ils ont été traités avec diverses concentrations de NH4CI. Dans les deux cas, nous avons observé une inhibition 9399 avec NH 4 Cl à 5 ​​mM. Ces données indiquent que NH 4 Cl (5 mM) et de la chloroquine (10 M) sont très efficaces pour réduire l'infection par le SRAS-CoV. Ces résultats suggèrent que les effets de la chloroquine et de NH 4 Cl dans le contrôle de l'infection du SRAS CoV et la propagation pourraient être médiés par le mécanisme (s) similaire. NH 4 Cl inhibe le SRAS-CoV pendant le traitement avant ou après l'infection. NH 4 Cl a été ajouté aux cellules, soit avant (A) ou après (B) infection, semblable à ce qui a été fait pour la chloroquine dans les figures 1 et 2. cellules positives à l'antigène ont été comptés, et les résultats ont été présentés comme dans la figure. 1B. Effet de la chloroquine et de NH4CI sur l'expression de surface cellulaire de l'ECA2 Nous avons effectué des expériences supplémentaires pour élucider le mécanisme de l'inhibition du SARS-CoV par la chloroquine et de NH4CI. Depuis pH acide intra-vésiculaire régule les fonctions cellulaires, y compris la N-glycosylation rognage, le trafic cellulaire, et diverses activités enzymatiques, il était intéressant de caractériser l'effet des deux médicaments sur le traitement, la glycosylation, et le tri cellulaire du SARS-CoV pic glycoprotéine et son récepteur, l'ECA2. Cytométrie de flux analyse a été effectuée sur des cellules Vero E6 qui étaient soit non traitées ou traitées avec des concentrations anti-SRAS-CoV très efficace de chloroquine ou NH 4 Cl. Les résultats ont montré que ni médicament a provoqué un changement significatif dans les niveaux de surface cellulaire ECA2, ce qui indique que les effets inhibiteurs observés sur l'infection par le SARS-CoV sont pas dues à l'absence de l'ECA2 disponible à la surface cellulaire (Fig. 5A). Nous avons ensuite analysé les formes moléculaires de endogène ECA2 dans des cellules Vero E6 non traitées et dans les cellules qui ont été pré-incubées pendant 1 heure avec différentes concentrations de chacune NH4CI (2,510 mM) ou de la chloroquine (1 et 10 M) et marquée avec 35 S - (Met) pendant 3 heures en présence ou en absence de drogues (figure 5B et 5C.). Dans des conditions normales, nous avons observé deux formes ACE2 immunoréactives, migrant à 113 kDa, respectivement (Fig. 5B. Piste 1). La protéine de 105 kDa est endoglycosidase H sensible, ce qui suggère qu'il représente le réticulum endoplasmique (RE) forme localisée, tandis que la protéine de 113 kDa est endoglycosidase H résistant et représente la forme Golgi modifiée de ACE2 19. La spécificité de l'anticorps a été confirmée par le déplacement des bandes protéiques immunoréactifs avec un excès ACE2 humaine recombinante soluble à froid (rhACE2 Fig. 5B. Voie 2). Lorsque nous avons analysé les formes d'ACE2 en présence de NH 4 Cl, une augmentation progressive claire dans la migration de la protéine de 113 kDa a été observée avec des concentrations croissantes de NH 4 Cl, avec un effet maximal observé à 10 mM de NH 4 Cl, ce qui entraîne seule la forme ER de ACE2 étant visible sur le gel (Fig. 5B. comparer les voies 35). Ceci a suggéré que les modifications de parage et / ou terminaux des chaînes N-glycosylées de l'ECA2 ont été affectés par le traitement de NH 4 Cl. En outre, à 10 mM NH 4 Cl, la forme d'ER de ACE2 migré à mobilité légèrement plus rapide, indiquant que NH 4 Cl à cette concentration pourrait également affecter la glycosylation core. Nous avons également examiné l'état de la glycosylation terminale de l'ECA2, lorsque les cellules ont été traitées avec de la chloroquine (fig. 5C). Semblable à NH4CI, une augmentation progressive de la mobilité électrophorétique de l'ECA2 a été observée avec des concentrations de chloroquine augmente. A 25 M chloroquine, la mobilité électrophorétique plus rapide de la forme Golgi modifiée de ACE2 était clairement évidente. Sur la base de la cytométrie de flux et immunoprécipitation analyses, on peut en déduire que NH 4 Cl et de la chloroquine à la fois affaiblies la glycosylation terminale de ACE2, tandis que NH 4 Cl a donné lieu à un effet plus dramatique. Bien que l'ECA2 est exprimée en quantité équivalente à la surface des cellules, les variations de son état de glycosylation susceptibles de rendre l'interaction ACE2-SARS-CoV moins efficace et inhibent l'entrée du virus lorsque les cellules sont traitées avec du NH4CI et de la chloroquine. Effet des agents lysomotropic sur l'expression de surface cellulaire et la biosynthèse des ACE2. (A) des cellules Vero E6 ont été cultivées pendant 20 heures en l'absence (contrôle) ou en présence de chloroquine (10 M) ou de NH4CI (20 mM). Les cellules ont été marquées avec un anti-ACE2 (en histogramme gris) ou avec un anticorps secondaire seul (histogramme blanc). (B) Biosynthèse de l'ECA2 dans des cellules non traitées ou des cellules traitées avec du NH4CI. Des cellules Vero E6 ont été marquées par impulsions pendant 3 heures avec de la 35S-Met et les lysats cellulaires ont été immunoprécipités avec un anticorps ECA2 (piste 1). Preincunbation de l'anticorps avec l'ACE2 humaine recombinante (rhACE2) abolit complètement le signal (piste 2). Les positions de la forme ER H sensible endoglycosidase et la endoglycosidase forme de Golgi H-résistante de ACE2 sont soulignés. A noter que la concentration croissante de NH4CI entraînant la diminution de la forme de Golgi ECA2. (C) Une expérience similaire a été réalisée en présence des concentrations indiquées de chloroquine. Notez la perte de glycanes terminaux avec des concentrations de chloroquine croissante. (D) La modification osidique terminale de l'ECA2 a été évaluée par traitement à la neuraminidase de l'ECA2 immunoprécipitée. Ici cellules ont été traitées avec 125 M concentrations de chloroquine pendant la famine, le pouls et 3 h chase. Pour confirmer que ACE2 subit des modifications sucres terminaux et que la glycosylation terminale est affectée par NH 4 Cl ou un traitement à la chloroquine, nous avons joué immunopreipitation de 35 S marqué ACE2 et soumis les immunoprécipités à la neuraminidase digestion. Les protéines ont été résolues par SDS-PAGE (figure 5D). Il ressort de la mobilité légèrement plus rapide de la forme Golgi de ACE2 après le traitement de la neuraminidase (figure 5D. Comparer les pistes 1 et 2), que ACE2 subit glycosylation terminale cependant, la forme d'ER de ACE2 n'a pas été affectée par la neuraminidase. Les cellules traitées avec 10 M chloroquine n'a pas abouti à un changement significatif alors que 25 M chloroquine a causé la forme Golgi d'ACE2 pour résoudre semblable à la neuraminidase traité ACE2 (figure 5D. Comparer les pistes 5 et 6). Ces données fournissent la preuve que ACE2 subit glycosylation terminale et que la chloroquine à des concentrations anti-SRAS-CoV abroge le processus. Effet de la chloroquine et de NH 4 Cl sur la biosynthèse et le traitement du SRAS-CoV protéine spike Nous avons ensuite abordées si les médicaments lysosomotropes (NH 4 Cl et chloroquine) affectent la biosynthèse, la glycosylation, et / ou le trafic de la pointe glycoprotéine SRAS-CoV. A cet effet, les cellules Vero E6 ont été infectées par le SRAS-CoV pendant 18 h. Chloroquine ou de chlorure d'ammonium a été ajouté à ces cellules au cours alors qu'ils étaient privés de nourriture (1 h), marqué (30 min) ou chassé (3 h). Les lysats cellulaires ont été analysés par immunoprécipitation avec l'anticorps polyclonal spécifique du SRAS (HMAF). Les résultats d'impulsion de 30 min a indiqué que pro-pic (SIRP) a été synthétisé comme 190 kDa précurseur (PROS-ER) et transformés en 80 kDa des protéines (Fig. 6A. Piste 2), un résultat identique à celui de notre analyse précédente 6. À l'exception de la chloroquine 100 M (Fig. 6A. Voie 3), il n'y avait pas de différence significative dans la biosynthèse ou la maturation de la protéine de spicule du virus dans les cellules non traitées ou traitées à la chloroquine (fig. 6A. Lanes 46). Il convient de noter que la chloroquine à 100 M a entraîné une diminution globale de la biosynthèse et dans les niveaux de la glycoprotéine du virus traité. Compte tenu de l'absence de réduction de la biosynthèse et de traitement de la glycoprotéine spike en présence de concentrations de chloroquine (10 et 50 M) qui ont causé d'importantes réductions dans la réplication du SRAS-CoV et la propagation, nous concluons que l'effet antiviral est probablement pas dû à l'altération du virus de la glycoprotéine de la biosynthèse et de traitement. Des analyses similaires ont été réalisées avec NH4CI, et les données ont suggéré que la biosynthèse et la transformation de la protéine de spicule sont pas non plus affectés négativement par NH4Cl (Fig. 6A. Lanes 712). Conformément à notre analyse précédente 6, nous avons observé la présence d'une protéine plus grande, qui est désigné ici comme oligomères. Récemment, Song et al. 20 ont fourni des preuves que ce sont homotrimères de la protéine spike SARS-CoV et ont été incorporés dans les virions. Fait intéressant, les niveaux des homotrimères dans les cellules traitées avec 100 H chloroquine et de 40 et 20 mM NH4Cl (Fig. 6A. Voies 3, 9 et 10) sont légèrement inférieurs à ceux des cellules témoins ou des cellules traitées avec des concentrations plus faibles de médicaments. Effets de NH 4 Cl et la chloroquine (CQ) sur la biosynthèse, le traitement et la glycosylation du SRAS-CoV protéine spike. cellules Vero E6 ont été infectées par le SRAS-CoV comme décrit dans la Fig. 2. CQ ou NH 4 Cl a été ajouté pendant les périodes de famine (1 h) et l'étiquetage (30 min) avec 35 S-Cys et suivie par la chasse pendant 3 h en présence d'un milieu non marqué. Les cellules ont été lysées dans un tampon RIPA et immunoprécipités avec HMAF. les protéines de virus ont été résolus en utilisant 38 gel NuPAGE (Invitrogen). Les cellules marquées ont été présentées pendant 30 min (A) et chassées pendant 3 heures (B). Les positions de migration des différentes formes moléculaires pointes sont indiquées sur le côté droit, et ceux des normes moléculaires sont indiquées sur le côté gauche. PROS-ER et PROS-Golgi sont les pro-pic du SRAS-Co dans les ER et Golgi compartiments, respectivement et PROS-ungly est le pro-pic ER non glycosylée. Les données obtenues à partir d'une impulsion de 30 minutes suivie d'une poursuite de 3 h (Fig. 6B. Voies 2 et 8) a confirmé notre observation plus tôt que le SRAS-CoV pic de protéine précurseur (PROS-ER) acquiert des modifications Golgi spécifiques (SIRP - Golgi) aboutissant à une protéine de 210 kDa 6. Chloroquine à 10, 25, et 50 M n'a eu aucun impact négatif important sur l'apparition de la forme de Golgi (Fig. 6B. Comparer piste 2 aux voies 46). Seulement à 100 M chloroquine était une réduction du niveau de la pro-pic Golgi modifié observé (piste 3). D'autre part, NH 4 Cl abrogé l'apparition de formes Golgi modifiées à 10 mM (comparer la piste 8 avec 911) et a eu un effet plus doux à 1 mM (piste 12). Ces données démontrent clairement que la biosynthèse et protéolytique traitement du SRAS-CoV protéine spike ne sont pas affectés à la chloroquine (25 et 50 M) et NH 4 Cl (1 mM) doses qui provoquent des effets inhibiteurs du virus. En outre, avec 40, 20, et 10 mM NH 4 Cl, il y avait une accumulation accrue de PROS-ER avec une diminution concomitante de la quantité d'oligomères (Fig. 6B. Lanes 911). Lorsque nous avons examiné les homotrimères, nous avons constaté que la chloroquine à 100 M et NH 4 Cl à 40 et 20 mM a donné lieu à une mobilité légèrement plus rapide des trimères (Fig. 6B. Voies 3, 9 et 10), mais des doses plus faibles de médicaments, qui ne présentent des effets antiviraux importants, n'a pas abouti à des différences notables. Ces données suggèrent que la protéine spike intracellulaire nouvellement synthétisé peut ne pas être une cible majeure pour la chloroquine et NH 4 Cl action antivirale. La mobilité plus rapide du trimère à une certaine concentration plus élevée des médicaments pourrait être due l'effet de ces médicaments sur la glycosylation terminale des trimères. Discussion Nous avons identifié chloroquine comme agent antiviral efficace pour le SRAS-CoV dans des conditions de culture cellulaire, comme en témoigne son effet inhibiteur lorsque le médicament a été ajouté avant l'infection ou après l'ouverture et à l'établissement de l'infection. Le fait que la chloroquine exerce un effet antiviral dans les conditions pré - et post-infection suggèrent qu'il est susceptible d'avoir des avantages à la fois prophylactiques et thérapeutiques. Récemment, Keyaerts et al. 21 ont rapporté les propriétés antivirales de la chloroquine et identifié que le médicament affecte la réplication du SRAS-CoV dans la culture cellulaire, comme en témoigne RT-PCR quantitative. Pris ensemble avec les conclusions de Keyaerts et al. 21, notre analyse fournit une preuve supplémentaire que la chloroquine est efficace contre les souches du SRAS-CoV Francfort et Urbani. Nous avons fourni des preuves que la chloroquine est efficace pour prévenir l'infection par le SARS-CoV dans une culture cellulaire si le médicament est ajouté aux cellules 24 heures avant l'infection. En outre, la chloroquine était significativement efficace même lorsque le médicament a été ajouté 35 h après l'infection, ce qui suggère un effet antiviral, même après la mise en place de l'infection. Etant donné que des résultats similaires ont été obtenus par NH 4 Cl traitement de cellules Vero E6, le mécanisme sous-jacent (s) d'action de ces médicaments peut être semblable. Outre le rôle probable de la chloroquine sur la réplication du SRAS-CoV, les mécanismes d'action de la chloroquine sur le SRAS-CoV sont pas pleinement compris. Des études antérieures ont suggéré l'élévation du pH comme un mécanisme par lequel la chloroquine réduit la transduction du SRAS-CoV pseudotype virus 17. 18. Nous avons examiné l'effet de la chloroquine et de NH 4 Cl sur les protéines pic CoV-SRAS et sur son récepteur, ACE2. les résultats d'immunoprécipitation de ACE2 ont clairement démontré que les concentrations anti-SRAS-CoV efficaces de chloroquine et de NH 4 Cl également porté atteinte à la glycosylation terminale de ACE2. Toutefois, la cytométrie en flux Les données ont démontré qu'il n'y a pas de différences significatives dans l'expression de surface cellulaire de l'ECA2 dans les cellules traitées avec de la chloroquine ou de NH4CI. Sur la base de ces résultats, il est raisonnable de penser que le prétraitement avec NH 4 Cl ou de chloroquine a éventuellement entraîné l'expression de surface de l'ECA2 sous-glycosylée. Dans le cas du traitement par la chloroquine avant l'infection, la dépréciation de la glycosylation terminale de ACE2 peut entraîner des affinités de liaison réduits entre ACE2 et le SRAS-CoV protéine spike et influencer négativement le début de l'infection du SRAS-CoV. Etant donné que la biosynthèse, le traitement, la modification de Golgi et oligomérisation de la protéine de spicule nouvellement synthétisé ne sont pas sensiblement affectée par des concentrations anti-SARS-CoV de chloroquine ou de NH 4 Cl, on en conclut que ces événements se produisent dans la cellule indépendante de la présence de les drogues. La contribution potentielle de ces médicaments dans l'élévation de pH endosomal et son impact sur l'entrée du virus ultérieure ou de sortie ne peut pas être exclue. Une diminution du SARS-CoV pseudotypes transduction, en présence de NH4CI a été observé et a été attribuée à l'effet du pH intracellulaire 17. 18. Lorsque chloroquine ou NH 4 Cl sont ajoutés après l'infection, ces agents peuvent rapidement augmenter le pH et de subvertir en cours d'événements de fusion entre le virus et les endosomes, inhibant ainsi l'infection. En outre, le mécanisme d'action de NH4CI et de la chloroquine peut dépendre du moment où ils ont été ajoutés aux cellules. Lorsqu'il est ajouté après le début de l'infection, ces médicaments peuvent affecter la fusion des endosomes à médiation par la réplication virale subséquente, ou l'assemblage et la libération. Des études antérieures ont démontré la chloroquine qu'il a des effets multiples sur les cellules de mammifères, en plus de l'élévation du pH endosomal, y compris la prévention de glycosyaltion terminale 22 d'immunoglobulines. Lorsqu'il est ajouté à des cellules infectées par un virus, la chloroquine inhibe les derniers stades dans vésiculaire la maturation du virus de la stomatite en inhibant l'expression de la glycoprotéine à la surface des cellules 23 et elle a inhibé la production de VIH-1 infectieux des particules en interférant avec la glycosylation terminale de la glycoprotéine 24. 25 . Sur la base de ces propriétés, nous suggérons que l'expression de surface cellulaire de la sous-glycosylée ACE2 et sa faible affinité pour le SRAS-CoV protéine spike peut être le principal mécanisme par lequel l'infection est empêchée par la drogue prétraitement des cellules avant infection. D'autre part, l'élévation rapide du pH endosomal et l'abrogation du virus-endosome fusion peut être le principal mécanisme par lequel l'infection virale est empêchée dans des conditions de post-traitement. analyses plus détaillées SRAS CoV pic-ACE2 de liaison en présence ou en absence de chloroquine seront effectués pour confirmer nos conclusions. Nos études indiquent que l'impact de NH4CI et de la chloroquine sur l'ECA2 et les profils de protéine de spicule sont significativement différentes. NH 4 Cl présente un effet plus prononcé que ne le fait la chloroquine sur glycosylation terminal, mettant en évidence le roman différences complexes entre la chloroquine et de chlorure d'ammonium en affectant le transport des protéines ou glycosylation du SRAS-CoV protéine de pic et de son récepteur, ACE2, en dépit de leur semblable bien établie effets de endosomal pH élévation. L'infectiosité des coronavirus autres que le SRAS-CoV sont également affectées par la chloroquine, comme en témoigne le CoV-229E humaine 15. Les effets inhibiteurs observés sur le SRAS-CoV infectiosité et de la cellule propagation se produit en présence de 110 M chloroquine, qui sont des concentrations plasmatiques réalisables au cours de la prophylaxie et le traitement du paludisme (variant de 1.612.5 M) 26 et sont donc bien toléré par les patients. Il a été récemment spéculé que la chloroquine pourrait être efficace contre le SRAS et les auteurs suggèrent que ce composé pourrait bloquer la production de TNF, l'IL6, ou IFN 15. Nos données fournissent des preuves pour la possibilité d'utiliser la chloroquine de drogue bien établie dans la gestion clinique du SRAS. Conclusion chloroquine, un médicament relativement sûr, efficace et pas cher utilisé pour le traitement de nombreuses maladies humaines, y compris le paludisme, amoebiosis et le virus de l'immunodéficience humaine est efficace dans l'inhibition de l'infection et la propagation du SRAS CoV en culture cellulaire. Le fait que le médicament a un effet antiviral inhibiteur significatif lorsque les cellules sensibles sont traitées avant ou après l'infection suggère une utilisation prophylactique et thérapeutique possible. Méthodes infection par le SRAS-CoV, immunofluorescence et immunoprécipitation analyses cellules Vero E6 (une ligne africaine de cellules de rein de singe vert) ont été infectées par le SRAS-CoV (souche Urbani) à une multiplicité d'infection de 0,5 pour 1 h. Les cellules ont été lavées avec du PBS puis incubées dans OptiMEM (Invitrogen) milieu avec ou sans diverses concentrations de chloroquine ou de NH4CI (tous deux de Sigma). Immunofluorescence a été réalisée avec du liquide d'ascite de souris hyperimmun SRAS-CoV spécifique (HMAF) 8 suivi d'un anticorps de fluorescéine couplé anti-souris. Dix-huit heures après l'infection, les surnageants contenant le virus ont été éliminés et les cellules ont été puisées avec 35 S - (Cys) pendant 30 minutes et chassées pendant 3 h avant la lyse dans un tampon RIPA. lysats et les médias de cellules ont été incubées avec Clarification HMAF, et les protéines immunoprécipitées ont été séparées par 38 gel NuPAGE (Invitrogen) protéines ont été visualisées par autoradiographie. Dans certaines expériences, les cellules ont été chassés pendant 3 h avec un milieu exempt d'isotopes. surnageants de cellules Clarification ont également été immunoprécipités avec HMAF SRAS-CoV spécifique. ECA2 cytométrie en flux et l'analyse des cellules Vero E6 biosynthèse ont été ensemencés dans un milieu Eagle de Dulbecco modifié (Invitrogen) additionné de 10 sérum de foetus de bovin. Le lendemain, les cellules ont été incubées dans OptiMEM (Invitrogen) en présence ou en absence de 10 M chloroquine ou 20 mM de NH4CI. Pour analyser les niveaux de l'ECA2 à la surface cellulaire, les cellules ont été mises en incubation sur de la glace avec 10 pg / ml de chèvre purifié par affinité l'anticorps anti-ACE2 (systèmes de RD), et les protéines immunoprécipitées ont été séparées par électrophorèse sur gel de polyacrylamide-SDS. Déclarations Remerciements Nous remercions Claudia Chesley et Jonathan Towner pour la lecture critique du manuscrit. Ce travail a été soutenu par une subvention canadienne de PENCE (T3), subvention de groupe des IRSC MGC 64518 et subvention des IRSC MGP-44363 (NGS). Auteurs fichiers soumis originaux pour les images ci-dessous les liens vers les auteurs originaux des dossiers soumis pour les images. Intérêts concurrents L'auteur (s) déclarent avoir aucun conflit d'intérêts. Auteurs contributions MV a fait toutes les expériences relatives à l'infection par le SRAS CoV et a coordonné la rédaction du manuscrit. EB et SB ont effectué des expériences sur ACE2 biosynthèse et de l'analyse FACS. Être effectué l'acquisition de données à partir des expériences d'immunofluorescence. PR et les savoirs traditionnels fournis réactifs critiques et révisés le manuscrit critique. NS et SN avec MV et EB ont participé à la planification des expériences, l'examen et l'interprétation des données et l'examen critique du manuscrit. Tous les auteurs ont lu et approuvé le contenu du manuscrit. Auteurs Affiliations Special Pathogens Brach, Division des Viral et rickettsioses, Centers for Disease Control and Laboratory prévention de la biochimie neuroendocrinienne, Institut de recherches cliniques de Montréal Références Ksiazek TG, Erdman D, Goldsmith CS, Zaki SR, Peret T, Emery S, Tong S , Urbani C, JA Comer, Lim W, Rollin PE, Dowell SF, Ling AE, Humphrey CD, Shieh WJ, Guarner J, Paddock CD, Rota PB, Fields B, DeRisi J, Yang JY, Cox N, Hughes J, LeDuc JW, Bellini WJ, Anderson LJ, Groupe de travail sur le SRAS: Un nouveau coronavirus associé au syndrome respiratoire aigu sévère. N Engl J Med 2003, 348: 1953-1966. 10,1056 / NEJMoa030781 Voir l'article PubMed Marra MA, Jones SJ, Astell CR, Holt RA, Brooks-Wilson A, Butterfield YS, Khattra J, Asano JK, Barber SA, Chan SY, Cloutier A, Coughlin SM, Freeman D, Girn N, Griffith OL, Leach SR, Mayo. McDonald H, Montgomery SB, Pandoh PK, Petrescu AS, Robertson AG, Schein JE, Siddiqui A, Smailus DE, Stott JM, Yang GS, Plummer F, Andonov A, Artsob H, Bastien N, Bernard K, Booth TF, Bowness D